23.7 FERTILIZACIÓNIN VITRO
El proceso de fertilización in vitro consiste en facilitar la unión de los gametos masculinos y femeninos para la formación del cigoto. Hay tres factores que impactan directamente en el resultado de este proceso. La calidad y maduración de ovocitos, la calidad y capacitación de los espermatozoides, y las condiciones de incubación durante la fertilización que incluye temperatura, atmósfera, composición del medio de fertilización y el tiempo de incubación.
23.7.1 EQUIPO PARA REALIZAR LA FERTILIZACIÓN IN VITRO
Para realizar la fertilización in vitro se necesita un microscopio estereoscópico idealmente con platina térmica, una platina térmica de mesa programada a 38.5 °C, descongeladora de semen, centrífuga, hematocitómetro o algún sistema computarizado para análisis de semen, incubadora que controle la temperatura a 38.5 °C con atmósfera húmeda con 5% CO2 y un vórtex (figura 11).
23.7.2 MEDIOS
Para el proceso de fertilización y cultivo las dos categorías principales de medios que se utilizan son Fluido Oviductal Sintético (SOF) y Tyrode’s albúmina-lactato-piruvato (TALP).
El fluido oviductal sintético es un medio utilizado frecuentemente en la producción de embriones bovinos. Este medio originalmente se basó en características bioquímicas de fluido oviductal ovino, y luego fue modificado con la adición de aminoácidos. Subsecuentes modificaciones consistieron en adición de citrato, remoción de glucosa y adición de iones como sodio, potasio, calcio, magnesio y fosfatos.
Cuando la base del medio Tyrode’s albúmina-lactato-piruvato se suplementa con hypotaurina, epinefrina, penicilina y metabisulfite se denomina Fert-TALP, el cual es utilizado al momento de la fertilización. Los medios Hepes-Talp son también con base en TALP, pero contiene cantidades reducidas de bicarbonato de sodio y solución HEPES, la cual permite mantener estable el pH en un medio determinado, de esta manera el pH del medio se mantiene en 7.4 fuera de la incubadora. Estos medios se utilizan para manipular y lavar los gametos entre los diferentes procesos de la producción de embriones in vitro (interactivo 4).
Teniendo en cuenta que la capacitación espermática tiene lugar en el aparato reproductivo femenino, se ha logrado que la capacitación espermática in vitro se lleve a cabo incubando espermatozoides en este medio fluido oviductal (SOF o TALP) suplementado con concentraciones variables de heparina que es imprescindible para la capacitación espermática bovina.
23.7.3 SELECCIÓN Y PREPARACIÓN DE SEMEN
La selección de toros en programas de cruzamiento se hace con base en las características genéticas deseadas, sin embargo, es necesario verificar la habilidad del semen para fertilizar in vitro. Actualmente no existen parámetros en el semen como motilidad, concentración, o incluso fertilidad a campo de los toros que permitan predecir la fertilidad in vitro. Por lo tanto, el semen de toros elegidos para producción de embriones mediante esta técnica debe ser probado previamente.
La concentración de semen que se desea en la gota de fertilización es generalmente de 1 millón de células/ml cuando se usa semen convencional, o el doble de concentración cuando se trata de semen sexado. En un estudio realizado se encontró que las concentraciones de 0.25 x 106 y 0.5 x 106 espermatozoides/ml generó mayor cantidad de blastocistos. La cantidad de espermatozoides en pajuelas de semen convencional es muy variable, por lo que se recomienda cuantificar la concentración de semen. Para ello se puede utilizar el sistema computarizado para análisis de semen, o se puede hacer conteo en un hematocitómetro.
23.7.4 PROCEDIMIENTO
El número deseado de espermatozoides, diluído en el medio de fertilización se deposita en micro gotas cubiertas con aceite mineral. El volumen de la microgota varía según el medio y condiciones a utilizar. En todos los casos, las microgotas para fertilización deben ser preparadas con dos horas de anticipación (mínimo) para permitir que el medio de fertilización, en la atmósfera de incubación, alcance el pH de 7.4. Simultáneamente, se agregan ovocitos maduros y lavados a las microgotas para co-incubar los gametos a 38.5 °C y 5% CO2. Algunos estudios sugieren que el tiempo de co-incubación de los gametos no afecta los resultados de PIV, incluyendo periodos de 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 horas. Asimismo, el proceso de fertilización implica secreción de proteasas por parte de los espermatozoides para digerir la zona pelúcida. Todos estos cambios bioquímicos en los gametos, se traducen en cambios en el microambiente que eventualmente puede tener efectos negativos sobre los cigotos (video 3).
