23.4 COLECCIÓN DE OVOCITOS
23.4.1 ASPECTOS GENERALES
En la mayoría de los laboratorios de investigación la fuente de ovocitos proviene de ovarios de matadero. Los ovocitos se pueden colectar por simple aspiración con aguja y jeringa o por disección (figura 2). Estos métodos solo pueden usarse en animales muertos o por ovariectomía siendo no repetible para un mismo animal. Técnicas quirúrgicas como laparoscopía y laparotomía también han sido utilizadas pero son muy costosas, requieren equipo complejo y anestesiar al paciente.
El método de colección de ovocitos ideal debe cumplir los siguientes requisitos:
- No causar problemas en la fertilidad futura del animal involucrado.
- No disminuir el rendimiento de la donadora (ejemplo: producción de leche).
- No alterar la calidad de los ovocitos colectados.
- Ser simple y fácil de realizar con mínima infraestructura.
- Ser altamente repetible.
- Poseer mínima invasibilidad.
- Estar dentro de las regulaciones para el bienestar animal.
Los programas de fertilización in vitro se comenzaron a utilizar para todas las vacas problema de alto valor genético. Las candidatas ideales eran todas aquellas en que la superovulación no era posible por diferentes causas anatómicas como oviductos bloqueados, adherencias y metritis persistentes (figura 3) o causas fisiológicas (vacas viejas o refractarias a los tratamientos de superovulación) pero con ciclos de desarrollo folicular normales o inducibles por otros tratamientos hormonales. Ahora se ha comenzado a usar en vacas con buen estado de salud.
Gracias al ultrasonido se pudo determinar que sólo los folículos antrales y con un diámetro superior a 2-3 milímetros, se pueden identificar y, en consecuencia, aspirar. Cada onda de crecimiento folicular se caracteriza por la movilización de folículos que también coincide con la etapa en la que el ovocito adquiere la competencia para someterse a la maduración, la meiosis y mantener el desarrollo posterior de embriones in vitro.
23.4.2 EQUIPO PARA LA COLECCIÓN DE OVOCITOS
Se requiere una estructura mínima para manejar animales de forma segura y eficiente, la cual, consiste en un corral de manejo y un lugar para poder montar un laboratorio de campo para la manipulación de los ovocitos. La contención correcta de los animales es fundamental para que el veterinario trabaje con precisión al momento de la aspiración de los folículos.
Los principales equipos para la técnica de OPU incluyen un ecógrafo, sonda transvaginal, guía de aspiración, bomba de vacío y línea de aspiración conectada a un tubo Falcon. La imagen de la pantalla del ecógrafo es utilizada para guiar la aguja de punción dentro del folículo ovárico, por lo tanto, la calidad de la imagen del equipo es de suma importancia (figura 4).
Para poder introducir el transductor en la vagina de la donadora, es indispensable el uso de la guía de aspiración folicular. Así, el transductor adquiere rigidez para poder llegar hasta el fondo de la vagina. En la parte superior de la guía existe un espacio para que pase un mandril en cuya punta se ensambla la aguja de aspiración que está conectada a la línea de aspiración. Por esta línea se transportan los ovocitos desde el folículo hasta el tubo colector con una bomba.
23.4.3 PROCEDIMIENTO
Con el animal inmovilizado se realiza una anestesia epidural para facilitar la manipulación ovárica por vía transrectal. El área perineal debe ser higienizada para introducir el transductor en la vagina, que va a estar protegido por medio de una camisa sanitaria con el objetivo de evitar contagio entre animales de distintas fincas (figura 5).
El transductor es manipulado y colocado en la parte más craneal de la vagina. Esta manipulación tiene por objeto colocar los folículos a aspirar en la línea de acción de la aguja de aspiración. La mano libre del operador se coloca por vía transrectal para localizar y traccionar los ovarios sobre la faz del transductor. Se mueve la aguja de aspiración a través de la pared vaginal insertándose dentro del folículo previamente identificado. El vacío en el tubo de colección se debe iniciar previo a la punción del folículo evitando de esta forma la pérdida del fluido folicular y del ovocito en la cavidad abdominal. El segundo folículo será aspirado sin tener que sacar la aguja del tejido ovárico. Al cambiar de ovario es recomendable retirar la aguja y hacer correr por ella líquido de colección o buffer fosfato salino (PBS) para purgar la vía de aspiración sin previo apagado de la bomba.
23.4.4 FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LA COLECCIÓN DE OVOCITOS
Las variables técnicas constituyen el método de obtención de los ovocitos y éstas poseen un impacto considerable sobre la cantidad y la morfología de los complejos y consecuentemente sobre la competencia para el desarrollo.
- Tipo de aguja: las agujas hipodérmicas desechables de 18G y 19G permiten buena tasa de recuperación, preservando la calidad de los ovocitos. Diámetros mayores a 19G se relacionan con mayores tasas de recuperación, pero con mayor proporción de ovocitos desnudos, mientras que las agujas de menor diámetro presentan índices reducidos de recuperación.
Presión de vacío: diferentes autores relacionan la baja presión (50 mm Hg), con aspiraciones ineficientes, mientras que con una presión mayor (120 mm Hg) se encuentran daños en el cumulus oophorus. Se ha demostrado que la velocidad de 22 ml/min es la más adecuada dando la mayor cantidad de ovocitos y de muy buena calidad (cuadro 4).
- Edad de la donadora: la cantidad de folículos en los ovarios varía considerablemente a través de la vida reproductiva de los bovinos. Vacas de un año de edad han perdido el 80% de la población original de ovocitos sanos. El número de folículos antrales está positivamente correlacionado con el tamaño del ovario en animales adultos jóvenes, y vacas con un bajo número de folículos antrales generalmente responden mal a la superovulación.
- Raza de la donadora: animales Bos indicus presentan un mayor número de folículos reclutados por onda en comparación con las vacas Bos taurus. Sorprendentemente, en un estudio reciente, no fueron encontradas diferencias significativas en el número de folículos pre-antrales en ovarios de fetos de vaquillas Bos taurus o Bos indicus, sugiriendo que el número superior de folículos y rendimiento superior en programas OPU de animales cebuinos puede estar asociado a una tasa de atresia folicular inferior. El número de ovocitos reclutados por onda en una vaca cebuina es el doble del observado en una Bos taurus (figura 6).
23.4.5 PROBLEMAS POST-ASPIRACIÓN
Normalmente los animales pueden ser sometidos a varias sesiones de aspiración sin mayores problemas (5 a 10 sesiones) para posteriormente ponerlos en descanso (gestación). La mayoría de las veces, los síntomas del animal indicarán el momento de descanso (figura 7).
La extensión de esas lesiones va a depender principalmente de cómo los procedimientos de anestesia y aspiración son conducidos por el veterinario y de la frecuencia de aspiración. Ovarios con muchos folículos, que son aspirados de forma más intensa, tienden a desarrollar más fibrosis y están más sujetos a adherencias que ovarios con pocos folículos.
23.4.6 ASPIRACIÓN FOLICULAR Y COLECCIÓN DE OVOCITOS DURANTE LA GESTACIÓN
Repetidas aspiraciones foliculares también son posibles en animales preñados durante el primer trimestre de la gestación. Posteriormente, los ovarios se encuentran en la cavidad abdominal dificultando o imposibilitando la técnica. Los animales preñados poseen ondas de crecimiento folicular similares a los animales no preñados. En un experimento se demostró que las vacas responden a tratamientos de superestimulación con una dosis completa de FSH, incrementándose significativamente la cantidad de folículos en el ovario. No se han reportado abortos o problemas en las preñeces. La mayoría de los ovocitos colectados eran viables y fueron usados en FIV con buenos resultados.
23.4.7 ASPIRACIÓN FOLICULAR Y COLECCIÓN DE OVOCITOS EN TERNERAS PREPÚBERES
El intervalo generacional es uno de los elementos más importantes en los programas de selección para la mejora genética en los bovinos. Derivar ovocitos o embriones viables de animales sexualmente inmaduros podría reducir dramáticamente el intervalo generacional y ofrecería una gran ventaja tanto en estos programas, como en investigación (figura 8).
Durante los últimos años ha sido documentado que los animales prepúberes poseen ondas foliculares como los adultos desde los 15 días de vida. La presencia de ondas foliculares y la capacidad de estos jóvenes animales para responder a la superestimulación exógena han sido demostradas ofreciendo una potencial fuente de producción de embriones in vitro. Las limitaciones principales para el desarrollo de esta técnica son el tamaño y diseño del transductor para terneras juveniles y la imposibilidad de fijar los ovarios por vía transrectal como en los adultos.
23.4.8 COLECCIÓN DE OVOCITOS DE OVARIOS DE MATADERO
Esta técnica permite la preservación de animales de alto valor genético post mortem. La aplicación masiva, sin embargo, se relaciona al uso de la maduración in vitro de ovocitos y la producción in vitro de embriones para investigaciones científicas.
Los ovarios son extraídos del aparato reproductivo inmediatamente después de la faena. Se van colocando en un recipiente con solución salina a temperatura ambiente. Una vez terminada la colección de ovarios, se enjuagan en solución salina para ser transportados al laboratorio a temperatura ambiente. En el laboratorio se seleccionan los ovarios que tengan muchos folículos antrales (entre 3-8 mm), descartando aquellos que no tienen folículos antrales del tamaño deseado. Los ovarios seleccionados son lavados nuevamente en solución salina a 38.5˚C y se mantienen sobre una platina térmica mientras se van procesando para la colección de complejos cumulus-ovocitos (interactivo 3).
La técnica de aspiración folicular con aguja y jeringa es la más utilizada en los laboratorios de producción in vitro de embriones bovinos. Para esto se utilizan jeringas, preferentemente sin émbolo de goma y agujas 18G. El líquido folicular se va aspirando de los folículos antrales que se observan y se transfiere a un tubo de 50 ml. El sedimento de la colección se transfiere a una placa con grilla para realizar la búsqueda de CCOs (figura 9).
