22.7 CRIOPRESERVACIÓN
La criopreservación de embriones bovinos es una técnica esencial asociada a la práctica comercial de la transferencia de embriones. Las ventajas de esta técnica hacen que se utilice a gran escala y aproximadamente la mitad de los 500.000 embriones que se transfieren anualmente en el mundo son criopreservados (cuadro 2).
La criopreservación reduce las dificultades logísticas de combinar la cantidad de embriones a ser transferidos con la cantidad de receptoras disponibles, ya que el estadio del embrión a ser transferido debe corresponder con el estadio endocrinológico de la receptora. Los embriones congelados pueden ser almacenados hasta tener receptoras disponibles en el momento apropiado.
Generalmente, se prefiere que los terneros nazcan en determinadas épocas entonces, los embriones congelados pueden ser descongelados y transferidos para alcanzar la época de parición deseada. Los embriones pueden ser colectados en un lugar, criopreservados, transportados y congelados en otro lugar, para ser transferidos. Finalmente, permite crear bancos de embriones.
Actualmente se utilizan diferentes protocolos con gran variedad de crioprotectores, tasas lentas o rápidas de congelado y descongelado.
Protocolos para congelar:
- 5 lavados con Holding (1/100 volumen de los embriones y no más de 10 embriones).
- 2 lavados con tripsina al 0.2% por 30-60 segundos.
- 5 lavados con Holding.
*Los embriones deben tener la zona pelúcida intacta, sin material adherido y ser observados a 50x de magnificación.
Todos los protocolos fueron diseñados para proteger a los embriones contra cristales de hielo intracelulares formados durante el congelado y la recristalización durante el descongelado. El agua intracelular es reemplazada por crioprotectores permeables y los embriones son deshidratados a una tasa relativamente lenta de enfriamiento. Para evitar la recristalización durante el descongelado se utilizan tasas relativamente rápidas de calentamiento.
22.7.1 CONGELACIÓN
Los procedimientos convencionales de congelado lento incluyen los siguientes pasos (figura 7):
Para sobrevivir a la criopreservación las células deben permanecer sin daño y fisiológicamente funcionales durante todo el proceso. Por lo tanto, la correcta implementación de cada paso es crítica.
Cuando el embrión se expone a crioprotectores, inicialmente, se encoge por la pérdida de agua a causa de hiperosmoralidad de la solución extracelular y porque el embrión es más permeable al agua que al crioprotector. El encogimiento va a continuar hasta que el flujo de agua sea balanceado por el flujo de ingreso del crioprotector. Este último entrará a las células embrionarias a una velocidad que dependerá del coeficiente de permeabilidad y la temperatura. El embrión aumentará nuevamente de tamaño y cuando la concentración de solutos fuera y dentro de las células llegue a un equilibrio (aproximadamente 10 minutos a 22°C para el glicerol y menos de 5 minutos para el etilenglicol) alcanzará su volumen original.
Los embriones se almacenan en nitrógeno líquido a -196°C. Normalmente, el medio con glicerol o etilenglicol 1.5 M se enfría por debajo del punto de congelación del agua sin la formación de cristales. Este fenómeno se llama súper enfriamiento (supercooling). Luego, se forma un núcleo de congelación a una temperatura más baja seguido por la liberación del calor latente de fusión (produciendo un aumento de temperatura) que afecta a los embriones. La inducción de la formación del núcleo de congelación previene el súper enfriamiento y los efectos negativos del congelamiento rápido que ocurren cuando se producen espontáneamente los núcleos de hielo. Una vez inducidos los cristales de hielo, los cristales pequeños tienden a crecer, proceso letal para las células. Por lo tanto, la formación de cristales se controla utilizando tasas de congelación lentas.
22.7.2 DESCONGELACIÓN DE EMBRIONES
Contrariamente a lo que ocurre con la congelación, la descongelación debe realizarse rápidamente (aproximadamente a 250°C/min) para evitar la recristalización. Se colocan las pajuelas con los embriones en agua tibia a 20-35°C durante 15 a 30 segundos.
Se comprobó una menor incidencia de zonas pelúcidas lesionadas si se mantiene a los embriones a temperatura ambiente por 10 segundos antes de colocarlos en agua tibia. Este es un paso importante cuando se descongelan embriones congelados en glicerol 1.5 M debido a que debemos manipular al embrión para sacar el crioprotector y la zona pelúcida facilita la identificación y manipulación del embrión bajo la lupa estereoscópica.
La criopreservación con etilenglicol tiene una clara ventaja comparada con otros métodos porque permite la transferencia directa de embriones bovinos sin retirar el crioprotector después del descongelado. No hay necesidad de utilizar un microscopio o llevar a cabo procedimientos de dilución muy complicados. Una vez en el útero, el crioprotector sale del embrión y éste se hidrata con agua de los fluidos del tracto reproductivo.
